Fluoreszierendes Licht zur berührungslosen Erkennung lebender Lachsläuse auf der Lachshaut

Kari Anne Hestnes Bakke*, Trine Kirkhus und Jon Tschudi

SINTEF Digital, intelligente Sensoren und Mikrosysteme, Forskningsveien 1, 0373 Oslo, Norwegen

* Korrespondierender Autor: kari.a.bakke@sintef.no

Abstrakt

Diese Arbeit stellt eine vielversprechende Methode zur automatischen, berührungslosen Erkennung und Zählung von Lachsläusen vor, die auf Lachsen in einer Aquakulturfarm befallen sind. Die Methode nutzt Chitin-Fluoreszenz im visuellen Teil des Spektrums, um den Kontrast zwischen Fischhaut und Lachsläusen zu verstärken, und zeigt, dass die Fluoreszenz sogar stark genug ist, um eine Echtzeitansicht des Verdauungs- und Fortpflanzungssystems lebender Läuse zu ermöglichen, ohne dass diese verwendet werden müssen von Farbstoffen. Die verwendeten Wellenlängen sind mit einem Unterwassermesssystem kompatibel.

Schlüsselwörter: Fluoreszenz / Bildgebung / Unterwasser / Lachslaus

© Die Autoren, veröffentlicht von EDP Sciences, 2023

1 Einleitung

Eine der größten Bedrohungen für die Lachszucht in Norwegen ist ein Ruderfußkrebs, die Lachslaus Lepeophtheirus salmonis (L. salmonis). Es kommt natürlicherweise im Meerwasser auf der gesamten Nordhalbkugel vor. Sie lebt und vermehrt sich auf Lachsen und Forellen im Meerwasser, und Läuse kommen das ganze Jahr über auf Lachsen in Aquakulturanlagen sowie auf Forellen und Lachsen in den Fjorden und entlang der Küste vor. Ein Läusebefall bei Lachsen kann zu Wunden in der Haut des Fisches führen und bei größeren Befall wird das Wohlbefinden des Lachses beeinträchtigt. Im Laufe der Jahre haben die Läuse Resistenzen gegen verschiedene medizinische Behandlungen entwickelt und in manchen Fällen besteht die einzige Lösung darin, sie an einer bestimmten Brutstätte zu töten. Um ein hohes Maß an Wohlbefinden aufrechtzuerhalten und die Ausbreitung von Lachsläusen zwischen Standorten zu verhindern, sollten Lachszüchter wöchentliche Läusezählungen bei einer repräsentativen Lachsgruppe durchführen, um sicherzustellen, dass die durchschnittliche Anzahl der an den Lachsen im Käfig hängenden Läuse weniger als 0,5 fruchtbare Weibchen beträgt Läuse pro Lachs. Zahlen müssen den Behörden gemeldet werden. Systeme zur automatischen Läusezählung erfreuen sich daher großer Beliebtheit. Allerdings ist die Zählung lebender Läuse mit einer Unterwasserkamera im Käfig anspruchsvoll. Das Zählsystem sollte Läuse (2–6 mm) auf dem lebenden Lachs (60 cm) aus 1 bis 2 m Entfernung durch Meerwasser zählen oder abbilden, während dieser mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 Fischlänge/Sekunde schwimmt. Andere Studien konzentrieren sich auf die Identifizierung und Zählung planktonischer L. salmonis-Stadien in Laborplanktonproben. Thompson et al. untersuchten, ob eine bestimmte Kombination von Anregungs- und Emissionsfiltern zur Fluoreszenz von L. salmonis führen und gleichzeitig die Fluoreszenz von Nichtzielplankton unterdrücken würde. Die Ergebnisse werden durch eine Anregungs- und Emissionsmatrix beschrieben. Die in [3] dargestellte resultierende Matrix ist jedoch auf die Anregung unter 580 nm und die Emission unter 600 nm beschränkt. Auf dieser Grundlage schlagen sie eine Anregungswellenlänge von 380 nm mit Emissionsdetektion bei einer Emissionswellenlänge von 474 nm oder eine Anregung bei 450 nm mit Detektion bei 516 nm zur Identifizierung von L. salmonis-Larven in Laborbildgebungssystemen vor.

2 Methoden und Experimente

In unserer Studie wurden die fluoreszierenden Eigenschaften von Lachs und Läusen untersucht, um eine Methode zur Verbesserung des Bildkontrasts zwischen Läusen und Haut in einem Spektralbereich zu finden, der unter Wasser angewendet werden kann. Dies vereinfacht die Bildanalyse und den Rechenaufwand und verringert den Bedarf an optischer Auflösung, da die Methode spezifisch genug ist. Wir hatten Zugang zu frisch geschlachtetem Lachs mit lebenden Läusen, der ins Meerwasser gebracht wurde. Untersucht wurden Eigenschaften von Läusen, Fischhaut und Meerwasser. Der Vishid hat große Farbvariationen und weist Flecken in Weiß, Grau und Schwarz auf. Die Läuse selbst sind halbreflektierend und teilweise transparent, und die Farbe des nicht transparenten Teils variiert von Läuse zu Läuse. Der Kontrast zwischen Läusen und Fischhaut in einem normalen Kamerabild ist daher sehr begrenzt. Es werden hochauflösende Kamerabilder von Läusen auf Fischhaut in der Luft bereitgestellt. Aufgrund des geringen Kontrasts sind zur Identifizierung der Läuse qualitativ hochwertige Bilder erforderlich. Es ist sehr schwierig, in einer realen Situation Bilder ausreichender Qualität (geringes Rauschen und hohe Auflösung) zu erhalten, und es wäre auch schwierig, den Prozess der Identifizierung der Läuse zu automatisieren. Um den Kontrast zu verbessern, ist es besonders attraktiv, die fluoreszierenden Eigenschaften zu berücksichtigen, da die Fluoreszenz von den unterschiedlichen chemischen Eigenschaften von Läusen und Lachsen abhängt. Die chemische Substanz des Co-Epoden der Läuse unterscheidet sich vom Fettlachs und seiner Fischhaut. Durch unsere Studien haben wir herausgefunden, dass bei Läusen mit einer grünen Anregungswellenlänge von 532 nm eine rote Fluoreszenzemission (>600 nm) erzielt werden kann. Dieser Satz von Anregungs-/Emissionswellenlängen verbessert auch den Kontrast der Lachshaut, da die Fluoreszenz der Lachshaut bei dieser Wellenlänge nicht angeregt wird [4]. Ein wichtiger Gesichtspunkt bei einem Unterwasser-Bildgebungssystem ist auch die Absorption von Licht in der Wassersäule selbst. In unserem Labor wurde die Anregung bei einer zentralen Wellenlänge von 380 nm mit einer Emission über 410 nm getestet. Unsere Messungen bestätigten, dass Lachsläuse bei Anregung in diesem Wellenlängenbereich ein Fluoreszenzsignal haben. Allerdings sind die Wellenlängen nicht mit den anderen Einschränkungen eines Bildverbesserungssystems kompatibel, das Läuse von der Lachshaut in einem entfernten Unterwasserbildaufbau trennt. Der Kontrast zwischen Läusen und Fischhaut wird nicht verbessert, da auch Lachshaut ein Fluoreszenzsignal aussendet und die Absorption von UV-Licht im Meerwasser aufgrund der unterschiedlichen organischen Stoffe in der Wassersäule unvorhersehbar ist. Das beste Transmissionsfenster im Meerwasser liegt im Bereich von 500–700 nm und die von uns vorgeschlagenen Wellenlängen eignen sich aufgrund ihrer geringen Absorption gut für den Einsatz unter Wasser. Im Bereich von 500 nm–700 nm werden 80–95 % des Lichts zum Detektor übertragen. Dies steht im Gegensatz zum Wellenlängenbereich unter 425 nm, wo wir weniger als 20 % des durchgelassenen Lichts durch eine 1 m hohe Wassersäule gemessen haben. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir ein Fluoreszenz-Bildgebungssystem aufgebaut. Zur Anregung wurden Halbleiterlaser bei 532 nm verwendet. Für die Kamera Canon EOS M6 II wurde ein Langpass-Glasfilter mit einer Grenzwellenlänge von 570 nm verwendet, um das Licht des Lasers zu blockieren, sodass die sichtbaren Wellenlängen über 570 nm den Kamerachip erreichen. Für eine hohe Bildauflösung wurde ein 28-mm-Makroobjektiv mitgeliefert. Zur Anregung wurden zwei Laser unterschiedlicher Leistung verwendet. Der Durchmesser der beleuchteten Punktbereiche betrug ungefähr 4 mm und 12–14 mm, was für beide Laser eine ähnliche Intensität ergibt.

3 Ergebnisse

Die Läuse sind 3-4 mm groß und das Sichtfeld ist ungefähr 10 mm x 15 mm. Für das vorgeschlagene Fluoreszenzbildungssystem wurde eine weiße Lichtquelle mit einer RGB -Kamera verwendet. Im Fluoreszenzbild können wir komplexe Details der Anatomie der Lachslaus beobachten. Wir erwarteten, das Exoskelett aus Chitin zu beobachten, und waren von dem detaillierten Bild der Lausanatomie überrascht. Nachdem wir die Details der These beobachteten, lernten wir aus der Literatur, dass Coppods nicht nur in ihrem Exoskelett Chitin haben, sondern auch als Teil ihres Verdauungs- und Fortpflanzungssystems. Diese Systeme sind in den Fluoreszenzbildern deutlich sichtbar. Der Kontrast zwischen Läusen und Lachshaut ist hoch, wie wir von unseren ersten Fluoreszenzmessungen erwarten können. In unserem Setup haben wir eine ziemlich lange Belichtungszeit oder 0,4–0,8 s und eine hochauflösende RGB-Kamera verwendet. Die Qualität dieser Bilder ist viel besser als für die Läuseerkennung erforderlich, sowohl hinsichtlich der Auflösung als auch in Bezug auf geringe Bildrauschen. Ein kommerzielles System muss die Bildqualität beeinträchtigen, um Bilder von ausreichender Qualität mit einer viel kürzeren Belichtungszeit zu erhalten. Zusätzlich zu den Bildern, die mit den oben genannten Einstellungen vermerkt sind, haben wir auch Video mit niedrigem Bildrate mit 0,1 Bildern pro Sekunde erfasst. Bei einem kreisförmigen, beleuchteten Bereich oder einem Radius von 0,9 cm wird die Gesamtlaserleistung von 50 mW über 2,5 cm 2 verteilt, wodurch eine durchschnittliche optische Leistung von ~ 20 mw/cm 2 und 2 mj/cm 2 pro Bildrahmen entsteht. Die resultierenden Bilder haben einen Kontrast von ca. 10. In einem kommerziellen Echtzeit-Läusezähler muss die optische Auflösung ein Kompromiss zwischen dem erforderlichen Bereich sein, der vom Rahmen und der Größe der zu untersuchenden Details abgedeckt werden soll. Eine Auflösung oder 0,2 mm pro Pixel ergibt 15 × 15 Pixel für typische Läuse oder 3 mm Länge. Dies sollte für die Erkennung der Läuse durch Bildanalyse ausreichend sein. Es müssen auch Anstrengungen unternommen werden, um eine geeignete Laserimpulsfrequenz und einen Spitzenleistungseffekt auszuwählen. Die Lachs kann mit einer Geschwindigkeit von 1 m/s schwimmen können. Es müssen Bilder auf Stopp-ähnliche Weise erfasst werden, um Unschärfe zu vermeiden. Um die Bewegung der Bildaufnahme der Fischdauer zu minimieren, benötigen wir einen gepulsten Laser mit einer Impulsbreite von etwa 0,5 ms und einer Tetitionsrate von 50 Hz. Wir können dann die Fische in Scheiben oder 2 cm mal 30 cm vorstellen, wenn der Fisch vorbeikommt. Jeder Impuls muss dann einen Peakeffekt von 240 W, um die optische Energie oder 2 mj/cm 2 pro Scheibe zu erhalten. Um den Anforderungsbereich oder 2 cm x 30 cm mit einer Auflösung oder 0,2 mm abzubilden, ist ein Kamera -Chip mit mindestens 100 × 1500 Pixel erforderlich. Weitere Untersuchungen sind noch erforderlich, um die erforderliche Mindestlaserleistung und die tatsächliche Konfiguration des Laser- oder Lasersatzes und der Kamera für die beste Leistung in einem Echtzeit-Läusezähler zu bestimmen.

4 Schlussfolgerung

L. Salmonis erzeugt ein Fluoreszenzsignal, wenn er mit grünem Licht (532 nm) angeregt wird. Die detaillierten Bilder stützen, dass die Fluoreszenz aus Chitin stammt, die sowohl des Exoskeletts als auch des Verdauungs- und Fortpflanzungssystems ist. Wir haben gezeigt, dass ein einfaches Kamerasystem, wie das im Labor eingerichtete, verwendet werden kann, um die Anatomie von lebenden Läusen zu untersuchen, ohne Farbstoffe wie Kongo -Rot als Fluoreszenzmarker zu verwenden. Der Weg nach vorne liegt in der Durchführung von Tests und experimentellen Arbeiten in größerem Maßstab, einschließlich der Messungen in einem Meerwassertank mit lebenden Läusen und lebenden Lachs. Auf diese Weise können wir bestätigen, dass das Bildgebungsprinzip skalierbar ist und als Live-Display und Echtzeitzahl von Lachsläusen in einer Lachsfarm realisiert werden kann. Weitere Untersuchungen umfassen die Untersuchung der Fluoreszenz anderer Partikel in der Wassersäule, die die Bildanalyse beeinträchtigen können, einschließlich Callanus- und Fluoreszenz -Futterpartien von Lachsfarmen.

Konflikt oder Interesse

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Edelsteine bestätigen

Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Steinsvik (jetzt Scaleak, https://scaleaq.no/) durchgeführt, der für die meisten experimentellen Arbeiten Finanzmittel, Lachs und lebende Läuse beisteuerte. Live -Läuse wurden von Anna Solvang Båtnes von NTNU zugesagt.

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