Fluorescenslys for kontaktløs påvisning av levende lakselus på lakshud

Kari Anne Hestnes Bakk*, Trine Kirkhus og Jon Tschudi

Sintef digitale, smarte sensorer og mikrosystemer, Forskningsveien 1, 0373 Oslo, Norge

* Tilsvarende forfatter: kari.a.bakke@sintef.no

 

Abstrakt

Dette arbeidet presenterer en lovende metode for automatisk, kontaktløs deteksjon og telling av lakselus som er infisert på laks i en havbruksgård. Metoden bruker fluorescens av kitin i den visuelle delen av spekteret for å forbedre kontrasten mellom fiskehud og lakselus og viser at fluorescens er til og med sterk nok til å gi et sanntidsbilde av fordøyelses- og reproduksjonssystemet i levende lus uten bruk av Fargestoffer. Bølgelengdene som brukes er kompatible med et undersjøisk målesystem.

Nøkkelord: Fluorescens / Imaging / Underwater / Salmon Louse

© De Autor (S), utgitt av EDP Sciences, 2023

 

1 Introduksjon

En av de største truslene for laksegården i Norge er en Coppode, den lepeophteirus laks lus salmonis (L. salmonis). Det forekommer naturlig i sjøvann i hele den nordlige halvkule. Den lever og planlegger laks og ørret i sjøvann, og lus finnes på akvakultursteder så vel som på ørret og laks i fjordene og langs kysten, gjennom året. Lus skadedyr i laks kan forårsake sår i huden på fisken, og laksens velferd vil avta hvis det er større angrep. Gjennom årene har lusene utviklet motstand mot forskjellige medisinske behandlinger, og i noen tilfeller er den eneste løsningen slakting på et spesifikt avlssted. For å holde brønnen på et høyt nivå og for å forhindre spredning av lakselus mellom lokasjoner, må laksebøndene utføre leverstativ på en representativ gruppe laks hver uke for å sikre at antall lus i buret er mindre enn mindre enn mindre enn 0,5 fruktbare hunnlus per laks. Tall må rapporteres til myndighetene. Systemer for automatisk folketelling av lus er derfor svært ettertraktede. Å utføre levende levering ved hjelp av et undervannskamera i buret er imidlertid krevende. Tellersystemet må telle lus (2–6 mm) på den levende laksen (60 cm) eller visualisere fra 1 til 2 m avstand gjennom sjøvann, mens du svømmer med en hastighet på omtrent 1 fiskelengde/sek. Andre studier som fokuserer på å identifisere og telle planktoniske L. Salmonis -stadier i planktonprøver i laboratoriet. Thompson et al. Resultatene er beskrevet av en eksitasjons- og utslippsmatrise. Imidlertid er den resulterende matrisen presentert i [3] begrenset til eksitasjon under 580 nm og utslipp under 600 nm. Basert på dette presenterer de en eksitasjonsbølgelengde på 380 nm med utslippsdeteksjon i emisjonsbølgelengde 474 nm eller eksitasjon ved 450 nm med deteksjon ved 516 nm for identifisering av L. salmonis larver i laboratoriebildedannelsesanlegg.

 

2 metoder og eksperimenter

I vår studie ble de fluorescerende egenskapene til laks og lus vurdert for å finne en metode for å forbedre bildekontrasten mellom lus og hud, i et spektralområde som kan påføres under vann. Dette vil forenkle bildeanalyse og beregningsbehov og redusere behovet for optisk oppløsning, da metoden er spesifikk nok. Vi hadde tilgang på nyslaktet laks med levende lus levert i sjøvann. Egenskaper til lus, fiskeskinn og sjøvann ble undersøkt. Vishiden har brede fargevariasjoner og har flekker i hvitt, grått og svart. Selve lusene er semi-reflekterende og delvis gjennomsiktige, og fargen på den ugjennomsiktige delen vil variere mellom lusene. Kontrasten mellom lus og fiskeskinn i et normalt kamerabilde er derfor svært begrenset. Høyoppløselige kamerabilder av lus på fiskeskinn i luften er gitt. På grunn av den lave kontrasten er det nødvendig med bilder av høy kvalitet for å identifisere lusene. Det er svært vanskelig å få bilder av tilstrekkelig kvalitet (lav støy og høy oppløsning) i en reell situasjon, og det vil også være vanskelig å automatisere prosessen med å identifisere lusene. For å forbedre kontrasten er det ekstra attraktivt å ta tak i de fluorescerende egenskapene, fordi fluorescensen avhenger av forskjellen i kjemiske egenskaper til lus og laks. Det kjemiske stoffet i co-epoden til lusen skiller seg fra den fete laksen og dens fiskeskinn. Gjennom våre studier fant vi at rød fluorescensemisjon (>600 nm) kunne oppnås fra lus ved å bruke en 532 nm, grønn, eksitasjonsbølgelengde. Dette settet med eksitasjons-/emisjonsbølgelengder forbedrer også kontrasten til lakseskinn, da laksehudsfluorescens ikke eksiteres ved bruk av denne bølgelengden [4]. En viktig faktor i et undervannsbildesystem er også absorpsjonen av lys i selve vannsøylen. Eksitasjon ved 380 nm sentral bølgelengde med emisjon over 410 nm ble testet i vårt laboratorium. Våre målinger bekreftet at lakselus har et fluorescerende signal når de eksiterer i dette bølgelengdeområdet. Imidlertid er bølgelengdene ikke kompatible med de andre begrensningene i et bildeforbedringssystem som skiller lus fra lakseskinn i et fjerntliggende undervannsbildeoppsett. Kontrasten mellom lus og fiskeskinn blir ikke bedre fordi lakseskinn også sender ut et fluorescerende signal, og absorpsjonen av UV-lys i sjøvann er uforutsigbar på grunn av varierende organisk materiale i vannsøylen. Det beste transmisjonsvinduet i sjøvann er i området 500-700 nm og bølgelengdene vi foreslår er godt egnet for bruk under vann på grunn av deres lave absorpsjon. Innenfor området 500 nm-700 nm sendes 80-95 % av lyset til detektoren. Dette står i kontrast til bølgelengdeområdet under 425 nm, hvor vi målte mindre enn 20 % transmittert lys gjennom en 1 m vannsøyle. Basert på disse funnene satte vi opp et fluorescensbildesystem. Halvlederlasere ved 532 nm ble brukt for eksitasjon. Et langpass, glassfilter med en bølgelengde på 570 nm ble brukt til Canon EOS M6 II-kameraet for å blokkere lyset fra laseren, noe som resulterte i at de synlige bølgelengdene over 570 nm nådde kamerabrikken. Et 28 mm makroobjektiv ble inkludert for høy bildeoppløsning. To lasere med forskjellig kraft ble brukt til eksitasjon. Diameteren til de opplyste punktområdene var omtrent 4 mm og 12–14 mm, noe som ga samme intensitet for begge lasere.

 

3 resultater

Lusene er 3-4 mm store og synsfeltet er omtrent 10 mm x 15 mm. En hvit lyskilde med RGB-kamera har blitt brukt for det foreslåtte fluorescensbildesystemet. I det fluorescerende bildet kan vi observere komplekse detaljer om anatomien til lakselusen. Våre forventninger var å observere eksoskjelettet laget av kitin, og ble overrasket over den detaljerte skildringen av lusens anatomi. Etter å ha observert disse detaljene, lærte vi fra litteraturen at copepoder har kitin ikke bare i deres eksoskeleton, men også som en del av deres fordøyelses- og reproduktive systemer. Disse systemene er godt synlige i fluorescensbildene. Kontrasten mellom lus og lakseskinn er høy, slik vi kunne forvente fra våre første fluorescensmålinger. I oppsettet vårt brukte vi en ganske lang eksponering på 0,4–0,8 s og et høyoppløselig RGB-kamera. Kvaliteten på disse bildene er mye bedre enn nødvendig for å oppdage lus, både når det gjelder oppløsning og lav bildestøy. Et kommersielt system vil måtte gi innrømmelser på bildekvalitet for å få bilder av tilstrekkelig kvalitet med mye kortere eksponeringstid. I tillegg til bildene som ble tatt med innstillingene ovenfor, tok vi også videoopptak med full oppløsning og lav bildefrekvens med 0,1 bilde per sekund. Gitt et sirkulært opplyst område med en radius på 0,9 cm, er den totale lasereffekten på 50 mW fordelt på 2,5 cm 2, noe som gir en gjennomsnittlig optisk effekt på ~20 mW/cm 2 og 2 mJ/cm 2 per bilderamme. De resulterende bildene har en kontrast på omtrent 10. I en kommersiell sanntids luseteller må den optiske oppløsningen være et kompromiss mellom det nødvendige området som skal dekkes per ramme og størrelsen på detaljene som skal studeres. En oppløsning på 0,2 mm per piksel gir 15 × 15 piksler for typiske lus på 3 mm lengde, og dette skal være egnet for å oppdage lusene ved bildeanalyse. Det bør også tilstrebes å velge en passende laserpulsfrekvens og toppeffekteffekt, da laksen kan svømme med en hastighet på 1 m/s. Det vil være behov for å ta bilder i en stop-motion-stil for å unngå uskarphet. For å minimere bevegelsen til fisken mens vi skaffer bildet, trenger vi en pulserende laser med en pulsbredde på omtrent 0,5 ms og en repetisjonshastighet på 50 Hz. Vi kan da avbilde fisken i skiver på 2 cm x 30 cm, mens fisken svømmer forbi. Hver puls må da ha en toppeffekt på 240 W for å oppnå den optiske energien på 2 mJ/cm 2 per skive. For å avbilde det forespurte området på 2 cm x 30 cm med en oppløsning på 0,2 mm, kreves det en kamerabrikke med minst 100 × 1500 piksler. Ytterligere forskning er fortsatt nødvendig for å bestemme minimum laserkraft som kreves og den faktiske konfigurasjonen av laseren eller lasersettet og kameraet for best ytelse i en sanntids luseteller.

 

4 Konklusjon

L. salmonis produserer et fluorescerende signal når den eksiteres med grønt lys (532 nm). De detaljerte bildene støtter at fluorescensen kommer fra kitin, som er en del av eksoskjelettet samt fordøyelses- og reproduktive systemer. Vi har vist at et enkelt kamerasystem, som det vi satte opp i laboratoriet, kan brukes til å studere anatomien til levende lus uten å bruke fargestoffer som Kongorødt som fluorescerende markør. Veien videre ligger i å gjennomføre tester og forsøksarbeid i større skala, inkludert målinger i sjøvannstank med levende lus og levende laks. Dermed kan vi bekrefte at avbildningsprinsippet er skalerbart og kan realiseres som en levende visning og sanntidstelling av lakselus i et lakseanlegg. Ytterligere forskning vil inkludere å undersøke fluorescensen til andre partikler i vannsøylen som kan forstyrre bildeanalysen, inkludert callanus og fluorescerende fôrpartikler fra lakseanlegg.

 

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

 

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble utført i samarbeid med Steinsvik (nå ScaleAQ, https://scaleaq.no/ ), som bidro med finansiering, laks og levende lus til det meste av forsøksarbeidet. Levende lus ble levert av Anna Solvang Båtnes fra NTNU

For mer informasjon eller et uforpliktende tilbud, vennligst kontakt oss, du kan også ringe +31 75 2022963