Fluorescentie licht voor contactloze detectie van levende zalmluizen op zalmhuid

Fluorescentie licht voor contactloze detectie van levende zalmluizen op zalmhuid

Abstract

1 Inleiding

Een van de grootste bedreigingen voor de zalmkwekerij in Noorwegen is een copepode, de zalmluis Lepeophtheirus salmonis ( L. salmonis ). Het komt van nature voor in zeewater op het hele noordelijk halfrond. Het leeft en plant zich voort op zalm en forel in zeewater, en luizen worden zowel op zalm in aquacultuurlocaties als op forel en zalm in de fjorden en langs de kust aangetroffen, het hele jaar door. Luizenplagen bij zalm kunnen wonden in de huid van de vis veroorzaken en het welzijn van de zalm zal afnemen als er grotere aanvallen zijn. In de loop der jaren hebben de luizen resistentie ontwikkeld tegen verschillende medische behandelingen en in sommige gevallen is de enige oplossing het afslachten op een specifieke kweek locatie. Om het welzijn op een hoog niveau te houden en de verspreiding van zalmluizen tussen locaties te voorkomen, moeten de zalmkwekers wekelijks luizentellingen uitvoeren op een representatieve groep zalmen om ervoor te zorgen dat het aantal luizen dat aan de zalm in de kooi vastzit gemiddeld minder is dan 0,5 vruchtbare vrouwelijke luizen per zalm. Aantallen moeten worden gemeld bij de autoriteiten. Systemen voor automatische telling van luizen zijn daarom zeer gewild. Het uitvoeren van levende luizentelling met behulp van een onderwatercamera in de kooi, is echter veeleisend. Het telsysteem moet de luizen (2–6 mm) op de levende zalm (60 cm) tellen of in beeld brengen vanaf 1 tot 2 m afstand door zeewater, terwijl deze zwemt met een snelheid van ongeveer 1 vislengte/sec. Andere studies, die zich richten op het identificeren en tellen van plank tonische L. salmonis stadia in planktonmonsters in het laboratorium. Thompson et al. hebben onderzocht of een specifieke combinatie van excitatie- en emissiefilters zou resulteren in L. salmonis- fluorescering, terwijl de fluorescentie van niet-doelwitplankton wordt onderdrukt. De resultaten worden beschreven door een excitatie- en emissiematrix. De resulterende matrix gepresenteerd in [3 ] is echter beperkt tot excitatie onder 580 nm en emissie onder 600 nm. Op basis hiervan stellen ze een excitatiegolflengte voor van 380 nm met emissiedetectie bij emissiegolflengte 474 nm of excitatie bij 450 nm met detectie bij 516 nm voor identificatie van L. salmonis -larven in laboratoriumbeeldvormingssystemen.

2 Methoden en experimenten

In onze studie werden de fluorescentie-eigenschappen van zalm en luizen beoordeeld om een methode te vinden om het beeldcontrast tussen luizen en huid te verbeteren, in een spectraal gebied dat onder water kan worden toegepast. Dit zal de beeldanalyse en de rekenbehoeften vereenvoudigen en de behoefte aan optische resolutie verminderen, aangezien de methode specifiek genoeg is. We hadden toegang tot pas geslachte zalmen met levende luizen die in zeewater werden afgeleverd. Eigenschappen van luizen, vishuid en zeewater werden onderzocht. De vishuid heeft grote kleurvariaties en heeft vlekken in de kleuren wit, grijs en zwart. De luizen zelf zijn semi-spiegelend en gedeeltelijk transparant, en de kleur van het niet-transparante deel zal variëren tussen luizen. Het contrast tussen luizen en vishuid in een gewoon camerabeeld is daarom zeer beperkt. Hoge resolutie camerabeelden van luizen op vishuid in de lucht worden gegeven. Vanwege het lage contrast zijn afbeeldingen van hoge kwaliteit nodig om de luizen te identificeren. Het is erg moeilijk om in een echte situatie beelden van voldoende kwaliteit (weinig ruis en hoge resolutie) te krijgen, en het zou ook moeilijk zijn om het proces van het identificeren van de luizen te automatiseren. Om het contrast te verbeteren, is het extra aantrekkelijk om de fluorescentie-eigenschappen aan te pakken, omdat de fluorescentie afhankelijk is van het verschil in chemische eigenschappen van luizen en zalm. De chemische substantie van de copepode van de luizen verschilt van de vette zalm en zijn vishuid. Door onze onderzoeken ontdekten we dat rode fluorescentie-emissie (> 600 nm) verkregen kon worden van luizen met behulp van een 532 nm, groene, excitatiegolflengte. Deze set van excitatie-/emissiegolflengten verbetert ook het contrast van zalmhuid, aangezien zalmhuidfluorescentie niet wordt geëxciteerd door het gebruik van deze golflengte [4 ]. Een belangrijk aandachtspunt bij een onderwaterbeeldvormingssysteem is ook de absorptie van licht in de waterkolom zelf. Excitatie bij 380 nm centrale golflengte met emissie boven 410 nm werd getest in ons lab. Onze metingen bevestigden dat zalmluizen een fluorescentiesignaal hebben wanneer ze worden geëxciteerd in dit golflengtebereik. De golflengtes zijn echter niet compatibel met de andere beperkingen in een beeldverbeterend systeem dat luizen van zalmhuid scheidt in een onderwaterbeeldvormingsopstelling die op afstand werkt. Het contrast tussen luizen en vishuid wordt niet verbeterd omdat de zalmhuid ook een fluorescentiesignaal geeft, en de absorptie van UV-licht in zeewater is onvoorspelbaar vanwege variërende organische materie in de waterkolom. Het beste transmissievenster in zeewater ligt binnen het bereik van 500-700 nm en de golflengtes die wij voorstellen zijn goed geschikt voor onderwatergebruik vanwege de lage absorptie. Binnen het bereik van 500 nm-700 nm wordt 80-95% van het licht doorgelaten naar de detector. Dit staat in contrast met het golflengtebereik onder 425 nm, waar we minder dan 20% doorgelaten licht hebben gemeten door een waterkolom van 1 m. Op basis van deze bevindingen hebben we een fluorescentiebeeldvormingssysteem opgezet. Halfgeleiderlasers bij 532 nm werden gebruikt voor excitatie. Een long-pass, glasfilter met cut-on golflengte van 570 nm werd gebruikt voor de Canon EOS M6 II camera om het licht van de laser te blokkeren, wat resulteerde in de zichtbare golflengten boven 570 nm die de camerachip bereikten. Een 28 mm macrolens werd opgenomen voor een hoge beeldresolutie. Twee lasers met verschillend vermogen werden gebruikt voor excitatie. De diameter van de verlichte spotgebieden was ongeveer 4 mm en 12–14 mm, wat een vergelijkbare intensiteit gaf voor beide lasers.

3 Resultaten

De Luizen zijn 3-4 mm groot en het gezichtsveld is ongeveer 10 mm x 15 mm. Er is een witte lichtbron met RGB-camera gebruikt, voor het voorgestelde fluorescentiebeeldvormingssysteem. In de fluorescentieafbeelding kunnen we complexe details van de anatomie van de zalmluis waarnemen. Onze verwachtingen waren dat we het exoskelet gemaakt door chitine zouden waarnemen, en waren verrast door de gedetailleerde afbeelding van de luizenanatomie. Nadat we deze details hadden waargenomen, leerden we uit de literatuur dat copepoden chitine niet alleen in hun exoskelet hebben, maar ook als onderdeel van hun spijsverterings- en voortplantingssystemen. Deze systemen zijn duidelijk zichtbaar in de fluorescentiebeelden. Het contrast tussen de luizen en de zalmhuid is hoog, zoals we konden verwachten van onze eerste fluorescentiemetingen.  In onze opstelling gebruikten we een vrij lange belichtingstijd van 0,4–0,8 s en een RGB-camera met hoge resolutie. De kwaliteit van deze beelden is veel beter dan nodig is voor het detecteren van luizen, zowel wat betreft resolutie als lage beeldruis. Een commercieel systeem zal concessies moeten doen aan de beeldkwaliteit om beelden van voldoende kwaliteit te krijgen met een veel kortere belichtingstijd. Naast de afbeeldingen die met de bovenstaande instellingen zijn verkregen, hebben we ook volledige resolutie, lage framerate videobeelden gemaakt met 0,1 frame per seconde. Gegeven een cirkelvormig verlicht gebied met een straal van 0,9 cm, wordt het totale laservermogen van 50 mW verdeeld over 2,5 cm 2 , wat een gemiddeld optisch vermogen van ~20 mW/cm 2 en 2 mJ/cm 2 per beeldframe oplevert. De resulterende afbeeldingen hebben een contrast van ongeveer 10. In een commerciële realtime luizenteller moet de optische resolutie een compromis zijn tussen het benodigde gebied dat per frame moet worden bedekt en de grootte van de te bestuderen details. Een resolutie van 0,2 mm per pixel geeft 15 × 15 pixels voor typische luizen van 3 mm lang, en dit zou geschikt moeten zijn voor het detecteren van de luizen door middel van beeldanalyse. Er moet ook moeite worden gedaan om een juiste laserpulsfrequentie en piekvermogenseffect te selecteren, aangezien de zalm met een snelheid van 1 m/s kan zwemmen. Er zal een behoefte zijn om beelden te nemen in een stop-motion-achtige manier om onscherpte te voorkomen. Om de beweging van de vis te minimaliseren tijdens het verkrijgen van de afbeelding, hebben we een gepulseerde laser nodig met een puls breedte van ongeveer 0,5 ms en een herhalingsfrequentie van 50 Hz. We kunnen de vis dan in plakjes van 2 cm bij 30 cm afbeelden, terwijl de vis voorbij zwemt. Elke puls moet dan een piekeffect hebben van 240 W om de optische energie van 2 mJ/cm 2 per plak te verkrijgen. Om het gevraagde gebied van 2 cm x 30 cm af te beelden met een resolutie van 0,2 mm, is een camerachip met ten minste 100 × 1500 pixels nodig. Er is nog steeds nader onderzoek nodig om het minimale laservermogen te bepalen dat nodig is en de daadwerkelijke configuratie van de laser of laserset en camera voor de beste prestaties in een realtime luizenteller.

4 Conclusie

L. salmonis produceert een fluorescentiesignaal wanneer het wordt geëxciteerd met groen licht (532 nm). De gedetailleerde beelden onderbouwen dat de fluorescentie afkomstig is van chitine, dat deel uitmaakt van zowel het exoskelet als het spijsverterings- en voortplantingssysteem. We hebben aangetoond dat een eenvoudig camerasysteem, zoals het systeem dat we in het lab hebben opgesteld, kan worden gebruikt om de anatomie van levende luizen te bestuderen zonder kleurstoffen zoals Congorood als fluorescentiemarker te gebruiken. De weg vooruit ligt in het uitvoeren van testen en experimenteel werk op grotere schaal, waaronder metingen in een zeewatertank met levende luizen en levende zalm. Zo kunnen we bevestigen dat het beeldvormingsprincipe schaalbaar is en kan worden gerealiseerd als live weergave en realtime telling van zalmluizen in een zalmkwekerij. Verder onderzoek zal bestaan uit onderzoek naar de fluorescentie van andere deeltjes in de waterkolom die de beeldanalyse kunnen verstoren, waaronder callanus en fluorescerende voerdeeltjes van zalmkwekerijen.

Belangenconflict

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd uitgevoerd in samenwerking met Steinsvik (nu ScaleAQ, https://scaleaq.no/ ), die bijdroeg met financiering, zalm en levende luizen voor het grootste deel van het experimentele werk. Levende luizen werden geleverd door Anna Solvang Båtnes van NTNU.